Objetivo general: Realización de fermentación en estado sólido (FES) usando como sustrato papa estéril y el microorganismo Aspergillus niger para la producción de la enzima alfa-amilasa.
Objetivo particulares:
Obtención y extracción de la enzima alfa-amilasa a partir de FES con el microorganismo A. niger.
Determinación de azúcares reductores por método de DNS y de proteínas por el método de Bradford.
Comparación de porcentajes rendimientos respecto a la fermentación en estado líquido (FEL).
Introducción
Como recordamos la fermentación se refiere a la utilización de microorganismos en un proceso metabólico de oxidación, anaeróbico o aeróbico, donde los microorganismos oxidan los hidratos de carbono de la materia orgánica, proporcionando esqueletos carbonados y energía en forma de ATP para el crecimiento de los mismos y liberando principalmente dióxido de carbono, amonio, nitrógeno, agua, metano, amoniaco entre otros.
En el siguiente reporte nos enfocaremos en la técnica de la fermentación en estado sólido (FES). Es importante que conozcamos las diferencias que representa la fermentación en estado sólido con respecto a la sumergida para el crecimiento de nuestro microorganismo, pues va a ser fundamental para comprender los porcentajes de rendimiento obtenidos tras los resultados de la práctica realizada.
La fermentación en estado sólido (FES) es un proceso de fermentación sobre un soporte sólido, el cual tiene un bajo contenido de humedad y ocurre en un estado no aséptico y natural de acuerdo a (Nigam and Singh, 1994).
La FES produce una alta concentración de producto con un relativamente bajo requerimiento energético (Mudgett et. al, 1992). Esta fermentación ha sido utilizada para la producción de alimentos, combustible, y enzimas.
Algunos ejemplos de enzimas producidas en FES son: celulasas, hemicelulasas, pectinasas, amilasas, proteasas, xilanasas. Mientras que de los microorganismos más comúnmente utilizados son: A. sojare, A. oryzae, A. niger, A. terreus, A. ustus Rhizopus oryzae Penicillium sp.; estos tres primeros referidos como GRAS (Generally Regarded as Safe) considerados generalmente como los más seguros de acuerdo a (Sing et al, 2008).
Tabla 1. En la siguiente tabla se presentan ejemplos de microorganismos y los metabolitos secundarios que fueron producidos a traves de FES en sus respectivos sustratos.
Acerca de los sustratos para la fermentación en estado sólido estos deben poseer la característica de ser insoluble en agua para mantener su condición de cultivo en estado sólido y deben de tener elevado contenido en carbohidratos y proteínas. La selección de sustratos depende de diversos factores como el tamaño de la partícula, el costo, espaciado entre partículas y composición de nutrientes y requerimientos. Los residuos agroindustriales son considerados los mejores sustratos ya que otorgan los nutrientes y espacio necesario para que el microorganismo crezca según lo redactado en (Chen et al., 2013). Existen además sustratos minerales y sintéticos como la perlita, gránulos de arcilla, espumas de poliuretano y esponjas. Algunos de los residuos agroindustriales más comunes son:
bagazo de caña de azúcar
salvado de trigo
arroz
maíz
residuos de yuca
residuos de vegetales
desperdicios de té
polvo de sierra
orujo de manzana
torta de aceite de coco
Las ventajas principales de FES de acuerdo a un documento de (Pandey et al., 2013) son que los medios de cultivo son simples, generalmente presentan un alto contenido de los nutrientes necesarios, baja actividad de agua libre es de gran ayuda para evitar las contaminaciones, la concentración natural del sustrato permite utilizar reactivos más pequeños, la aireación forzada es facilitada por la porosidad, los conidios producidos son más resistentes y adaptables y los procesos se consideran como tecnologías limpias. Dentro de las desventajas encontramos que una humedad excesiva provoca contaminación del medio o bajo crecimiento, dificultad para su escalamiento a niveles industriales, no es posible medir condiciones como el pH y (...), se limita al crecimiento de hongos filamentosos, un mayor tiempo de fermentación (5-7 días).
El crecimiento en forma de micelio y su tolerancia a bajas actividades de agua hacen que los hongos sean la microflora natural más adecuada para la fermentación sólida; así respecto a Aspergillus niger, el hongo perteneciente a la división Ascomycota, color oscuro, que corresponde a los hongos filamentosos a los cuales no se les conoce una forma sexuada para su reproducción, fue el utilizado en la práctica.
Aspergillus niger es la especie más abundante en la naturaleza. Se encuentra destruyendo los alimentos y materiales vegetales de fácil fermentación, es decir, que contienen cantidades apreciables de azúcares y almidón.
A. niger se reproduce por conidios, localizados en el ensanchamiento terminal del conidióforo. Tiene gran potencial biótico por lo que es degradador de materia orgánica; sin embargo pueden causar enfermedades en animales y humanos como sinusitis, aspergilosis y otitis.
A pesar de su reputación de producir reacciones alérgicas y enfermedades, es utilizado comúnmente en la industria alimentaria para producir enzimas. Es muy usado en la industria de la fermentación para producir amilasas o ácido cítrico (Viniegra, 2003).
Figura 1. Las diferencias que representa Aspergillus niger respecto a Saccharomyces cerevisiae se presentan a modo de cuadro comparativo.
Metodología experimental
Resultados
Discusión
Sobre Aspergillus niger
Según (Pandey, 2002) podemos basarnos en la naturaleza de los microorganismos usados para saber en qué medio nos dará su mejor rendimiento. Los hongos son comúnmente utilizados en FES debido a su tolerancia relativa a las bajas cantidades de agua, su alto potencial para excretar enzimas, y por su morfología característica, que les permite el crecimiento sobre y a través de la matriz sólida reportado por (Franco, 2007). Aquí también se describe que el crecimiento de los hongos sigue un patrón de segmentos bien diferenciados, los cuales crecen por iteraciones repetidas dando lugar a estructuras ramificadas; lo que permite que el micelio atraviese la matriz sólida (cereales, granos, semillas, etc, de la FES) y se propague a través de esta.
Según epa.gov, Aspergillus niger es uno de los hongos más utilizados y su fermentación se realiza en recipientes increíblemente grandes (a veces de un tamaño que llega a los 100.000 litros) y luego es procesado para obtener celulasa, invertasa, amiloglucosidasa, amilasa, lactasa, proteasa ácida y pectinasa.
Sobre el sustrato: papa estéril
La papa es un tubérculo ampliamente consumido a nivel mundial por su alta calidad energética. De acuerdo con (Prada, 2012) se reportan porcentajes de humedad aproximada del 75% y un 25 – 30% de materia seca. de la cual proteína 6-12%, fibra 1-10% cenizas 4-6% y contenido de almidón del 60-80%, específicamente, los almidones de este tubérculo son la amilasa y la amilopectina en la proporción de 1:3. Lo que la convierte en un sustrato adecuado que permite optimizar la calidad de los componentes nutricionales de cultivos ricos en carbohidratos. Debido a que la mayor parte de los sustratos empleados son poliméricos (almidón, celulosa) en FES estos necesitan ser previamente degradados por las enzimas extracelulares, las limitaciones difusionales intraparticulares son importantes a considerar (Pastrana, 1996); es decir cuando el tamaño del poro es pequeño, es conveniente minimizar las limitaciones difusionales disminuyendo el diámetro de las partículas. De ahí fue la importancia de usar el material rayado o molido.
Humedad durante la fermentación
El porcentaje de humedad es un parámetro primario en las fermentaciones, porque este debido a él dependerá del crecimiento del microorganismo. Es el factor más decisivo sobre una fermentación en estado sólido. Las especies del género Aspergillus no tienen su rendimiento óptimo en medios líquidos, ya que se desarrollan en medios con humedad alta sin llegar a una humedad del 100% .Es más fácil el estudio del rendimiento de Aspergillus niger en medio sólido, debido a los nutrientes, concentración de glucosa y limitación de oxígeno, de acuerdo con (Raimbault, 1998). El contenido inicial en humedad del sustrato oscila entre el 30 y el 75%. En la práctica se controló la humedad de la fermentación con un vaso de precipitados con alrededor de 50 mL de agua en la incubadora. Es importante mencionar que un alto contenido en humedad provoca en numerosas situaciones descensos de la porosidad y por consiguiente de la difusión del oxígeno, aumenta el riesgo de contaminación bacteriana e incrementa la formación de micelio aéreo, efectos que se deben prevenir en una fermentación en estado sólido.
Efecto de FES y FEL sobre Aspergillus niger
Tabla 2 . Efecto de la técnica de fermentación y la condición de agitación sobre la producción de tanasa por Aspergillus niger (Hamada etal. , 2012). En esta tabla FES (SSF) exhibió una cantidad menor de actividad de tanasa respecto a fermentación sumergida (SmF), sin embargo existen informes anteriores que confirman la producción de tanasa por SSF fue mayor que el sistema SmF. (Lekha etal., 1994)
Porcentajes de rendimiento obtenidos: FES VS. FEL
La actividad específica (AE) es igual a la relación entre la cantidad de proteína que se purifica sobre la cantidad de proteína total. Mientras que el grado de purificación es el cociente de la AE en la etapa 2 sobre la AE en la etapa 1 (la purificación global, AE final sobre AE inicial) de acuerdo con (IIB-INTECH, 2009)
El porcentaje obtenido para Aspergillus niger en FES fue de 95.32%, mientras que para Saccaromyse cerevisae, fue de 20.51% , esto demostró un mayor porcentaje de rendimiento en la fermentación en estado sólido de Aspergillus niger.
De acuerdo con un artículo publicado por (Tomasini, et al., 2003) se reportan estudios donde usaron FES para la obtención de metabolitos primarios y secundarios, enzimas; la comparación de FES vs FEL mostró que la primera reportó un mayor rendimiento y productividad con el uso de hongos. La FES además ofrece notables ventajas biotecnológicas, como la estabilidad de los productos y adaptabilidad de los microorganismos (especialmente los hongos) al sistema, con bajo contenido de agua libre (Granda et al., 2005). Reportado por último en (Fernández, 2009) en los últimos años, la FES ha mostrado ser muy prometedora en el desarrollo de algunos bioprocesos y productos, sin embargo a nivel industrial se requieren mejoras en los aspectos de ingeniería y socioeconómicos por los procesos a gran escala, biorreactores.
Conclusión
Se realizó una fermentación en estado sólido con papa estéril como sustrato y utilizando el microorganismo Aspergillus niger observando las variables que influyen en su crecimiento.
Comparación de porcentajes de rendimiento de dos tipos de fermentaciones (FES y FEL) con diferentes microorganismos.
Concluyendo un porcentaje de rendimiento del 95.32%, el cual es un valor relativamente alto, lo que nos demuestra que la papa es un buen sustrato para Aspergillus niger en una fermentación en estado sólido.
Cuestionario Post-Laboratorio
1. ¿Qué efecto tiene la falta de control de las condiciones ambientales en el adecuado desarrollo de la FES?
Las condiciones ambientales, tales como la humedad, la actividad del agua, el pH, la temperatura, la concentración y disponibilidad del sustrato, la aireación, el tamaño de partículas y la forma de inoculación afectan significativamente el crecimiento y la formación de productos. Por ejemplo si hay un aumento de la temperatura se van a favorecer tres inconvenientes: la actividad microbiana se desacelera o se detiene, se deshidrata el medio sólido, y el metabolismo se desvía como un mecanismo de defensa ante el calor o ante la deshidratación de acuerdo con (Gutiérrez y col., 1995).
2. ¿Cómo cambiarían los resultados obtenidos si el proceso de producción se hubiera llevado a cabo en un biorreactor?
La FES es lenta y presenta problemas para la transferencia de calor y masa. Por lo que los biorreactores homogeniza los componentes del sistema y las condiciones óptimas para el crecimiento microbiano y la obtención del producto deseado. En estos hay un mayor control de las condiciones ambientales (Ruiz,2007), por lo que el crecimiento del microorganismo sería más preciso.
3. Teóricamente, ¿qué diferencias existen entre los extractos enzimáticos obtenidos con células libres y mediante FES?
En la FES se reporta mejora en la calidad nutritiva del sustrato, la composición de la pared, la membrana celular y cambios en los carbohidratos estructurales por lo que de acuerdo con (Chen, 2013) estos subproductos son utilizados como fuentes de energía para el crecimiento de la población de microorganismos, mismos que originan el incremento en la concentración de proteína.
4. Teóricamente, ¿la actividad enzimática es diferente entre los dos extractos, por qué?
Sí, debido al cambio en los carbohidratos estructurales, estas modificaciones en el transporte de azúcares cambian la actividad enzimática haciendo una diferencia en la de el extracto de célula libres.
5. Plantee un diseño experimental que permita conocer las condiciones óptimas de producción de amilasa mediante FES.
Se puede plantear el diseño de un biorreactor ya que como antes se mencionaba, su diseño debe asegurar la homogeneidad de los componentes del sistema y condiciones óptimas para el crecimiento microbiano y la obtención de nuestro producto deseado, en este caso la amilasa.
El biorreactor debe proporcionar según (Ruiz,2007) de mecanismos de agitación, dispersión y aireación, sistemas para el control de la temperatura, pH, debe funcionar asépticamente durante numerosos días, para evitar la aparición de contaminantes, mantener las células uniformemente distribuidas en todo el volumen de cultivo, entre otras.
Referencias
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