Objetivos
Objetivo general:
Determinar dos curvas de calibración para la cuantificación de proteínas con albúmina de huevo y otra curva para azúcares reductores con glucosa. Utilizando el método Bradford y el método de DNS para cada curva respectivamente.
Objetivos específicos:
Preparar adecuadamente los reactivos de Bradford y DNS.
Realizar dos curvas de calibración con ayuda de un espectrofotómetro para leer la absorbancia.
Identificar el fundamento de estos métodos.
Obtener una gráfica y fórmula de cada curva de calibración para su posterior.
Introducción
“Un procedimiento analítico muy utilizado en análisis cuantitativo es el llamado de calibración que implica la construcción de una “curva de calibración”. Una curva de calibración es la representación gráfica de una señal que se mide en función de la concentración de un analito. La calibración incluye la selección de un modelo para estimar los parámetros que permitan determinar la linealidad de esa curva. y, en consecuencia, la capacidad de un método analítico para obtener resultados que sean directamente proporcionales a la concentración de un compuesto en una muestra, dentro de un determinado intervalo de trabajo” (Dosal, 2008).
Así mismo, determinar la concentración de proteínas y/azúcares en una muestra biológica es una técnica de rutina básica cuando se aborda un esquema de purificación de una proteína concreta, cuando se quiere conocer la actividad específica de una preparación enzimática, para el diagnóstico de enfermedades, así como para otros muchos propósitos.
“Uno de los métodos más sencillos, accesibles, útiles y utilizados es la espectroscopía, en general, y la espectroscopía ultravioleta-visible, en particular. Se pueden identificar y cuantificar biomoléculas en solución y en muestras biológicas, con el empleo de reactivos específicos que reaccionan con el compuesto a analizar y forman un producto coloreado que permite detectarlo en muestras complejas. La espectrofotometría UV-visible es una técnica analítica que permite determinar la concentración de un compuesto en solución. Se basa en que las moléculas absorben las radiaciones electromagnéticas y a su vez que la cantidad de luz absorbida depende de forma lineal de la concentración, de acuerdo con la ley de Lambert-Beer. Para hacer este tipo de medidas se emplea un espectrofotómetro, en el que se puede seleccionar la longitud de onda de la luz que pasa por una solución y medir la cantidad de luz absorbida por la misma” (Díaz & Barcenas, 2008).
Existen diferentes métodos para la cuantificación de proteínas y azúcares. Muchos de estos métodos se basan en: a) la propiedad intrínseca para absorber luz, que puede ser medida con ayuda de un espectrofotómetro, b) para la formación de derivados químicos, o c) la capacidad que tienen de unirse ciertos colorantes.
La determinación de proteínas puede llevarse a cabo mediante diferentes métodos, siendo, de acuerdo a Stoschek (1990), el ensayo de Bradford uno de los más sencillos, rápidos y bastante exactos para muestras que van de 1μg a 20μg.
“La cuantificación de azúcares puede ser resuelta utilizando el ensayo con ácido 3,5-dinitrosalicílico, el cual reacciona con aquellos azúcares que son reductores (poseen su grupo carbonilo intacto, y que a través del mismo pueden reaccionar como reductores con otras moléculas). El producto formado de esta reacción absorbe fuertemente la longitud de onda de 540 nm y por tanto las muestras pueden ser leídas en un espectrofotómetro” (Bedford, 2000).
En el procedimiento de construcción de la curva de calibración se compara una propiedad del analito con la de estándares de concentración conocida del mismo analito (o de algún otro con propiedades muy similares a éste). La etapa de calibración analítica se realiza mediante un modelo de línea recta que consiste en encontrar la recta de calibrado que mejor ajuste a una serie de “n” puntos experimentales. La recta de calibrado se encuentra definida por una ordenada al origen (b) y una pendiente (m), mediante la ecuación y = mx + b, donde “y” representa la respuesta provocada por un cambio de la concentración de analito “x”.
Método en diagrama de flujo
Método de Bradford
Método DNS
Discusión y resultados
Método de Bradford: Determinación de proteína
La albúmina es una sustancia protéica orgánica nitrogenada, viscosa, soluble en agua, contenida en la clara de huevo.La clara tiene un 88 por ciento de agua y el resto está constituido básicamente por proteínas de la clara, siendo la principal la ovoalbúmina, que representa el 54 por ciento del total proteico (UNAM, s.f).
En esta práctica, se tenía por objetivo la determinación de la proteína mencionada anteriormente, por el método de Bradford.
El método de Bradford se basa en la unión de colorantes; debido a que, en condiciones adecuadas, los grupos ácidos o básicos de las proteínas pueden interaccionar con grupos orgánicos de determinados colorantes para dar lugar a precipitados con un color característico.
Para este método, se utiliza el colorante Coomassie Brillant Blue G- 250. Se basa en la conversión de la forma leuco del colorante (marrón-naranja) a una de color intensamente azul cuando los grupos aniónicos del colorante interaccionan con los grupos amino de las proteínas. Dicha reacción se mide por absorbancia a 595nm y también existe una relación lineal dentro de determinadas concentraciones de proteínas (Bradford M.M, 1976).
Este método es muy rápido y sensible y se puede trabajar en un rango de 20 a 140 microgramos de proteína para el ensayo estándar y de 1 a 50 microgramos para el microensayo (Tena M., Jorrín J., 2002).
En nuestro caso, se trabajó con un ensayo estándar, y se prepararon 11 diluciones distintas de albúmina de huevo, las cuales se procedió a pasar al espectrofotómetro a una longitud de onda de 595nm, por duplicado, obteniendo los siguientes resultados:
RÉPLICA 1
Se obtuvieron las siguientes absorbancias a las concentraciones dadas.
Para poder analizar estos datos de una manera más sencilla, se procede a linealizarlos (usualmente, los fenómenos naturales no siguen funciones lineales, pero se pueden convertir a una), a través de una regresión lineal, utilizando el método de los mínimos cuadrados, y así se obtiene la curva de calibración.
y = 0.002x + 0.0397
R^2= 0.9814
Para determinar si se trata de una linealización aceptable y que se puedan utilizar posteriormente los resultados, se debe calcular el valor de R2, el cual, se encuentra en un rango entre 0 y 1.
Para tomarse en cuenta, debe tener un valor mínimo de 0.98. En nuestro caso, el valor obtenido para los datos anteriores, corresponde a 0.9814, por lo cual, podemos decir que se realizó el procedimiento de manera correcta, y nos podemos fiar de los resultados.
RÉPLICA 2
En la segunda réplica, se obtuvieron las absorbancias que se muestran a continuación
Desde antes de realizar la regresión lineal, podemos observar que existen fallas en estos datos, pues se esperaría que la absorbancia siempre fuera en aumento y nunca superara el valor de 1.
A pesar de que el segundo requerimento sí se cumple, no sucede así con el primero, pues se puede observar una disminución de A entre las concentraciones de 150 a 175.
De igual manera, se procedió a realizar la regresión lineal para así, obtener la curva de calibración, obteniendo lo siguiente:
y = 0.0017x + 0.025
R^2= 0.8787
En esta curva, se puede observar claramente que existen desviaciones grandes entre cada uno de los datos, por lo que se obtiene un valor para R2 mucho más pequeño, el cual, en este caso, es de 0.8787.
Al tratarse de un valor menor a 0.98, no se puede utilizar para cálculos posteriores, por lo que la segunda réplica se puede considerar como despreciable, y se deja así, a la primera, para realizar futuros cálculos.
Existen diversos factores a considerar, tales como la sensibilidad, el límite de deteccióno cuantificación, etc.
Existe un rango de absorbancia óptima para la medición (alrededor de 0.15-0.7). Esto debido a que en la zona de alta absorbancia se producen desviaciones como consecuencia de que la luz que logra pasar es casi nula y se confunde con el ruido de fondo. Este rango depende de la calidad del aparato, incluso hay algunos que llegan a valores de 3 en absorbancia, pero llevan implícito cierto error. Esto se conoce como desviaciones instrumentales (Gary, 2009).
También pueden ocurrir desviaciones químicas de la ley de Beer producto de que las especies que forman la muestra interactúan y se desvía de la linealidad; esto ocurre a altas concentraciones (Gary, 2009).
Método DNS: Cuantificación de azúcares reductores
El Ácido 3,5-dinitrosalisílico (DNS), es un agente oxidante para un azúcar reductor. Éste compuesto es utilizado para la cuantificación de azúcares reductores en una muestra problema (Tena M., Jorrín J., 2002). En nuestro caso utilizamos el DNS para realizar una curva de calibración con muestras patrón de glucosa a diferentes concentraciones.
El reactivo de DNS está conformado por:
Ácido 3,5-dinitrosalisílico
Hidróxido de sodio (NaOH)
Fenol
Tartrato de sodio-potasio tetrahidratado
Sulfato de sodio
La reacción que se genera entre el DNS y el azúcar reductor es de tipo redox, ya que el DNS se reduce en presencia del grupo reductor de la glucosa (aldehído) formando un grupo carboxilo oxidado. Provocando un cambio de color en la muestra donde la concentración y el color de la muestra son proporcionales.
Estos cambios de color se deben al preparación de la muestra con el reactivo, se calienta la muestra por 5 minutos para la oxidación de la glucosa y se enfría por 10 minutos para detener la reacción, haciendo que la glucosa adquiera de nuevo su configuración. El tartrato de sodio-potasio y el hidróxido de sodio aportan el medio requerido para que la reacción redox ocurra (Chaplin M.F., 1986).
De esta forma el ácido 3,5 dinitrosalicílico se vuelve el compuesto ácido 3-amino, 5-nitrosalicílico, donde podemos ver en la estructura, que el grupo amino obtiene esta nueva estructura gracias a la oxidación de la glucosa, haciendo un cambio de amarillo a rojo en diferentes tonalidades, dependiendo la concentración de glucosa (Chaplin M.F., 1986). Después de que esta reacción ocurra, están listas las muestras para ser corridas por espectrofotometría con una longitud de onda de 540 nm.
Se realizó por duplicado este método, linealizando ambos resultados y buscando que esta linealización nos de una R2 mínima de 0.98, para así validar nuestro método.
RÉPLICA 1
Se obtuvieron las siguientes absorbancias de las muestras:
Con estos datos procedemos a linealizarlos por la forma y=mx+b, con ayuda de un programa numérico (Excell) obteniendo la ecuación, su gráfico y su valor de mínimos cuadrados R^2:
y = 0.9682x - 0.0839
R² = 0.91803
Como podemos ver, el gráfico tiene un dato atípico en la concentración de 0.8 microgramos/mL, debido a que esa muestra se contaminó durante su manipulación, debido a este dato tenemos una R^2 que no es confiable para tenerla como referencia. La dispersión de los datos no son del todo lejanos, pero si marcan una diferencia notable para tener una R^2 de ese valor.
RÉPLICA 2
Se obtuvieron las siguientes absorbancias de las muestras:
De igual forma que en los otros resultados procedemos a linealizarlos con excell obteniendo su gráfico, ecuación de la forma y=mx+b y su valor de mínimos cuadrados R^2:
y = 1.1473x - 0.0704
R² = 0.98025
Como podemos observar ahora el gráfico, vemos que los puntos se ajustan de una manera más pegada a la línea formada, reduciendo así la distancia de los puntos a la recta, es por eso que se obtiene una R^2 de 0.9802, con la cuál ya podemos confiar y trabajaremos con ella durante el semestre.
Conclusiones
Se logró determinar las absorbancias de las concentraciones tanto de la proteína como la de la azúcar reductora, para posteriormente linealizar los datos obtenidos de absorbancia y concentración; obteniendo en ambas situaciones una r^2 > 0.98, con la que se pudo construir una curva de calibración precisa. Obteniendo las gráficas y la fórmula de linealización de los datos para sacar concentraciones posteriores de nuestras curvas de calibración.
No se preparó ningún reactivo, pero se aprendió a cómo hacerlos teóricamente y cuál es el fundamento con el cuál trabajan los dos métodos.
Referencias
Tena Aldave M., Jorrín Novo J. V. (2002) Extracción y ensayo de la actividad invertasa de levadura de pan, Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Universidad de Córdoba [PDF] obtenido de: http://www.uco.es/dptos/bioquimica-biol-mol/pdfs/31%20INVERTASA%20ENSAYO.pdf
UNAM (s.f) El huevo, características y estructura, FES Cuautitlán, Ingeniería en Alimentos, [PDF] obtenido de: http://avalon.cuautitlan2.unam.mx/pollos/m2_9.pdf
Chaplin MF (1986) Monosaccharides. En Chaplin MF, Kennedy JF (eds.): “Carbohydrate Analysis: A Practical Approach”. IRL Press (Oxford, England) pp. 1-36.
Gary C. (2009) Química Analítica, 6ta edición, Ed. Mc Graw Hill, Estados Unidos.
Dosal, M. (2008). INTRODUCCIÔN A LA METROLOGÎA QUÎMICA CURVAS DE CALIBRACIÓN EN LOS MÉTODOS ANALÍTICOS. México, D.F, México: Departamento de Química de la UNAM.
Diaz, N., & Barcenas, J. (2008). Espectrofometría: Espectros de absorción y cuantificación colorimétrica de biomoléculas. Verazcruz, México: Universidad de Córdoba.
Bredford, M. (2000). Enzymes in farm animal nutrition. Cambridge, U.K: Bittles Ltd.
Stoscheck, CM. Quantitation of Protein. Methods in Enzymology 182: 50-69 (1990).