Objetivo general:
Producción y purificación de la enzima alfa amilasa a partir de una fermentación en medio líquido (FML) empleando la Saccharomyces cerevisiae para su posterior estudio enzimático.
Objetivos particulares:
Obtención de la enzima alfa amilasa por medio de la fermentación en medio líquido (FML).
Extracción de enzima y purificación de enzima por el método de salting out.
Conteo de células usando la cámara de Neubauer para conocer la densidad celular.
Determinar existencia de actividad enzimática por los métodos de Bradford, DNS, y yodo-lugol.
Introducción
Antes de adentrarnos a la metodología utilizada en la práctica es importante repasar conceptos básicos para comprender el proceso de la purificación de la enzima alfa amilasa.
Podemos preguntarnos primero ¿qué es una proteína?; las proteínas son biomoléculas formadas por cadenas de aminoácidos. Una cadena superior a 50 aminoácidos es considerada una proteína, y estos están unidos por un enlace peptídico, dando forma a cuatro diferentes estructuras:
Primarias: Una sola cadena de a.a.
Secundarias: Estructura alfa hélice o beta laminar
Terciarias: Unión de varias estructuras secundarias y primarias (Enzimas).
Cuaternarias: Son globulares, están compuestas por varios protómeros.
La importancia de las proteínas reside en que desempeñan diversas funciones biológicas y constituyen casi la mitad del peso seco de la mayor parte de los organismos.
Las enzimas son proteínas que tienen la función de catalizar reacciones químicas de manera específica. Actúan sobre una sustancia que se le llama sustrato, unido a la región concreta de la enzima: el sitio activo, para la formación de los productos. Todas la reacciones que catalizan las enzimas entonces consisten en un primer paso que es la unión no covalente del sustrato a la enzima, el llamado complejo sustrato:
E + S ↔ ES
Un catalizador es una sustancia que modifica el mecanismo de la reacción, su velocidad, y se regenera durante el proceso; por lo que al final de este se puede recuperar. Las enzimas se clasifican por su acción catalítica específica en las reacciones bioquímicas:
Óxido-reductasas: facilitan la transferencia de electrones de una molécula a otra
Transferasas: transferencia de grupos funcionales.
Hidrolasas: reacciones de hidrólisis, rompen moléculas.
Liasas: adición o eliminación de enlaces.
Isomerasas: transformación de una molécula a otra.
Ligasas: unión de moléculas.
La alfa-amilasa es una hidrolasa que actúa sobre los polisacáridos, específicamente sobre el sustrato almidón estando principalmente presente en glándulas salivales y en la función exócrina del páncreas.
La cantidad de almidón desdoblado para un determinado tiempo, es la medida de la actividad enzimática presente en la muestra. Esta enzima se puede obtener por medio de la fermentación.
De forma cualitativa se utilizó la prueba del yodo, debido a que el yodo forma un complejo azul con el almidón, cuya intensidad de color disminuye al aumentar la actividad de amilasa en la muestra. Los resultados de la prueba se muestran en este reporte en la sección correspondiente.
Sabemos que necesitamos la fermentación para la obtención de la enzima, así que recordemos en lo que consiste este proceso.
La fermentación es un proceso de tipo catabólico, es decir, de transformación de moléculas complejas, en moléculas simples y también un proceso anaeróbico, dando como producto final un compuesto de tipo orgánico, el cual caracteriza por lo general, a los distintos tipos de fermentaciones existentes.
- Tipos de fermentación FERMENTACIÓN LÁCTICA:
piruvato + NADH + H+-------> ácido láctico + NAD+
Se produce en muchas bacterias, también en algunos protozoos y en el músculo esquelético humano. Es responsable de la producción de productos lácteos acidificados (yoghurt, quesos, crema ácida, etc).
FERMENTACIÓN ALCOHÓLICA: Dos reacciones sucesivas.
piruvato --------> acetaldehido + CO2 acetaldehido + NADH +H+ -------> etanol + NAD+
Se lo encuentra en levaduras , otros hongos y algunas bacterias. La fermentación alcohólica es la base de las siguientes aplicaciones en la alimentación humana: pan, cerveza, vino y otras.
La fermentación utilizada en la práctica fue en medio líquido (FML): un cultivo de células microbianas dispersas en forma homogénea en un recipiente agitado, esta técnica permite al cultivo de organismos aeróbicos en condiciones homogéneas con una densidad moderada de biomasa.
Necesitamos a las levaduras debido a que estas tienen la capacidad de realizar la descomposición mediante fermentación de diversos cuerpos orgánicos; principalmente los azúcares o hidratos de carbono, produciendo distintas sustancias.
Las levaduras son entonces oxidativas, fermentativas, o bien su actividad metabólica es a la vez de ambos tipos; y sus productos son generalmente enzimas capaces de descomponer estos diversos sustratos.
Como se menciona en el título de la práctica la levadura utilizada fue Saccharomyces cerevisiae.
Es un hongo levaduriforme que presenta células alargadas, globosas a elipsoidales, se encuentra entre los principales organismos eucariotas productores de amilasas de la familia 13 y 15. Contiene la glucoamilasa que se caracteriza por poseer un dominio rico en serina y treonina en lugar de un dominio de unión al almidón en su región amino.
Su actividad es máxima entre pH 4 y 5.5 y temperatura alrededor de 55°C y 65°C.
Las células de la levadura se multiplican rápidamente por gemación, una forma asimétrica de reproducción asexual: a partir de una célula se origina una protuberancia que va creciendo y acaba dando lugar a otra célula, más pequeña (al principio) que la célula inicial y diferenciada genéticamente de la célula original.
Ahora que conocemos esto debemos ahora considerar los medios de cultivo utilizados para la reactivación y producción de la enzima a partir de Saccharomyces cerevisiae. Un medio de cultivo es el conjunto de nutrientes con determinadas condiciones ambientales que permiten que los microorganismos crezcan y se reproduzcan. Aporta la fuente de carbono, nitrógeno, elementos minerales, factores de crecimiento, agua y pH adecuado.
Los medios de cultivo se pueden clasificar en definidos cuando su composición química se conoce totalmente y complejos cuando no es el caso porque están compuestos por mezclas de extractos de materiales complejos (extracto de levadura, extracto de carne, etc.).
Los medios generales para crecer hongos contienen peptona, una fuente de energía, como hidratos de carbono y agar. Las levaduras crecen a temperatura ambiente, una presión de oxígeno de 1 atmósfera y a un pH ligeramente ácido, lo cual puede ayudar a que no crezcan bacterias en este medio tan rico.
Un medio más completo con el que se puede crecer levaduras (comúnmente S. cerevisiae), en el laboratorio es YEPD (yeast extract peptone dextrose) o YPD. En él se incluye extracto de levadura, normalmente un 1% en proporción masa/volumen con el agua, 2% de peptona, 2% de glucosa o dextrosa como fuente de energía y agua doble destilada.
El medio de activación que se preparó fue con la finalidad de brindar un medio nutritivamente rico con un ambiente favorable, que proporciona factores que permiten el crecimiento del microorganismo.
¿Cómo fue nuestro medio de activación? Se pesaron: 0.03602 g de levadura para 20 mL y esta fue activada con 80 mL de dextrosa Sabouraud
La levadura liofilizada comercial para panificación utilizada fue S. cerevisiae, esta fue activada con caldo de dextrosa Sabouraud. La dextrosa Sabouraud es utilizada para el cultivo de hongos patógenos. La alta concentración de dextrosa y la acidez del pH hacen a éste un medio selectivo para hongos.
El medio necesitaba un pH inicial de 4.5 (aprox), que es un pH idóneo para el crecimiento de levaduras.
El medio de producción consistió en una solución de nutrientes que permitió la iniciación de la fermentación en estado líquido de Saccharomyces cerevisiae.
¿Cómo es nuestro medio de producción ? Nuestro medio de cultivo es semisintético; que son los sintéticos a los que se les añaden factores de crecimiento bajo una forma de un extracto orgánico complejo, como por ejemplo extracto de levadura. Está conformado de:
K2HPO4 (0.87 g) Actúa como regulador de pH del medio de cultivo.
MgSO4 (0.12 g) Favorece el crecimiento proporcionando iones esenciales.
Almidón (15.4 g) Promueve el desarrollo eliminando factores tóxicos del medio de cultivo. Además es factor fundamental para la producción de la enzima amilasa.
Extracto de levadura (0.02 g) Extracto soluble en agua de un autolisado de células de levaduras, es utilizado en medios de cultivo como fuente de nutrientes.
(NH4)2SO4 (1.32 g) Todas las levaduras son capaces de utilizar nitrógeno en forma de amonio. Los iones amonio pueden ser aportados en el medio el sulfato amónico que es el mejor compuesto ya que aporta al mismo tiempo azufre necesario para la síntesis de ciertos aminoácidos.
Existen diferentes técnicas para el recuento de células una vez que obtuvimos la producción en nuestro medio, ya que necesitamos conocer el crecimiento que se llevo a cabo, de tipo:
Celular
Cámara de conteo directo
Cámara de Neubauer
Número Más Probable
Extensión en placa (UFC)
Vertido en placaFiltración
Masa
Peso seco Peso húmedo Turbidimetría
El instrumento utilizado para el recuento de levaduras fue la cámara de Neubauer. Debido a algunas ventajas de al ser un método sencillo, poco costoso,tiene un mejor seguimiento al cultivo debido a su inspección visual y por la obtención de una buena reproducibilidad.
Cuando las células son pequeñas y la concentración de los cultivos es muy alta, es preferible utilizar el cuadro central marcado para el recuento, consta de 400 cuadros: 25 cuadros pequeños, y a su vez divididos en 16 cuadros más pequeños. El cuadro más pequeño: 0.05 mm x 0.05 mm = 0.0025 mm^2 mientras que las levaduras miden alrededor de 2 a 4 µm. Por lo cual se considero realizar el conteo con la ayuda del microscopio (objetivo de 10x) en este cuadro y de forma diagonal, exceptuando los que tocan el el límite derecho y el inferior.
Se consideró a todas las levaduras como "vivas", ya que no se hizo una prueba para considerar sólo a las células viables.
La fórmula a utilizar se adjunta a continuación, así como el diagrama del cuadro central donde se realiza el recuento:
Figura 1. Fórmula general para la Cámara de Neubauer para conocer la densidad celular (Arredondo et al., 2014)
El volumen útil de la cámara Neubauer= 0.2mm x 0.2mm x 0,1mm x 25 = 0,1 mm
Los resultados del recuento están el la sección correspondiente, los cálculos en la sección de anexos.
Lo primero que se realiza para la separación de la enzima, consiste en la separación de los distintos componentes intracelulares, y generalmente se hace por centrifugación, como fue el caso en la práctica.
Las partículas difieren en densidad y sedimentan a distintas velocidades por la aplicación de la fuerza centrífuga. Al sobrenadante obtenido, extracto libre de células, fue al que se le aplicó la técnica de purificación de la enzima elegida.
Para la purificación existen diversas técnicas, a continuación se mencionan algunas:
Separación por precipitación
Ultrafiltración
Cromatografía por filtración de gel
Cromatografía por intercambio iónico
Cromatografía por afinidad
Nos enfocamos en la purificación de la enzima por precipitación, nuestra propiedad seleccionada a la proteína que se quiere purificar, fue en nuestro caso por solubilidad.
La solubilidad de la proteína depende de la carga de sus aminoácidos, si en su mayoría son polares, ésta será más soluble que una con a.a. hidrófobos.
A el proceso de salting-in y -out se le llama a la de saturación de una proteína con alguna sal.
Salting-in se refiere a las interacciones que hace la proteína al añadir poca concentración de sal, al aumentar la cantidad y hacer que el medio acuoso en el que está la proteína, empieza a ser menor, se le conoce como salting-out.
La sal puede ayudar a que los grupos con carga de la proteína se estabilice y su solubilidad mejore, pero si aumentamos la concentración salina, la proteína tendrá cada vez menos agua donde se pueda disolver y se comenzará a precipitar debido a la falta de interacción molecular.
Debido a esto el proceso utilizado fue el de SALTING OUT que consiste en la proteína cuando es sobresaturada con la sal, y comienza el proceso de precipitación, la solubilidad de ésta disminuye.
La concentración salina no es la misma para todas las proteínas, por lo que es útil esta propiedad para separar distintas proteínas de un medio mixto.
Para llevar a cabo la precipitación debemos de tener en cuenta los grados de saturación a los que queremos llegar según la sal utilizada. (ver Anexos para tablas correspondientes).
La sal se puede preparar en una disolución sobresaturada o directamente al volumen, dependiendo de la saturación y la metodología a seguir.
La que se utilizó en la práctica fue de manera directa al volumen. Se utilizó el sulfato de amonio como agente precipitante debido a que es la sal más usada debido a su alta solubilidad y su bajo costo.
Fueron necesarias condiciones que es importante mencionar debido a que nos ayudan a evitar o minimizar factores en la manipulación de las proteínas durante el proceso de purificación: se suele llevar a cabo en disoluciones tamponadas (nuestro buffer de fosfatos, pH= 7) , a bajas temperaturas (4ºC) y se procura que el proceso sea lo más corto posible.
Tras la comparación de condiciones de precipitación en diferentes artículos relacionados con la purificación de la enzima alfa amilasa, se obtuvo el siguiente cuadro:
Figura 2. Cuadro de comparación de referencias
Tras la revisión de los resultados de los artículos antes mencionados, y la comparación de la efectividad de cada una de las condiciones propuestas, se llegó a un acuerdo como equipo donde las condiciones elegidas para nuestra precipitación fueron las que a nuestro criterio e investigación, obtuvieron mejores resultados de la tabla 1.
Saturación: 60% agregando directamente el sulfato
Temperatura: 0-4 ºC
rpm: 13,500 por 15 minutos
pH: buffer de fosfatos 7
Tiempo de reposo precipitando: 1 hr. 5 min.
Metodología
Activación de la levadura
Preparación del medio de cultivo (medio de producción)
Inoculación del medio de producción
Producción de enzima
Precipitación
Resultados
Conteo de densidad celular por Cámara de Neubauer
Prueba cualitativa en maizena (almidón) de la muestra
Pruebas de DNS y Bradford después de la precipitación
DNS y Bradford después de la segunda centrifugación
Discusión
En la práctica realizada la producción de la enzima alfa amilasa, requirió de dos etapas principales: la fermentación, donde se multiplicó el microorganismo productor de la enzima, y la extracción y purificación en la que se aisló la enzima y se llevó a un cierto grado de pureza.
Según Sanghvi (2009), en su ensayo de purificación obtuvo la mejor actividad enzimática a una saturación del 60%. De esta manera se decidió hacer la saturación de sulfato de amonio para la precipitación con el 60%.
Utilizando la tabla de porcentajes de saturación (ver Anexos); observamos las concentraciones en mg por cada ml de solución para precipitar a dicha saturación. Obteniendo para nuestros cálculos que por cada mL agregaremos 361 mg de sulfato de amonio en 25 mL totales.
Utilizando esta sal, nos basamos en la Serie de Hofmeister (ver Anexos) donde categoriza a los aniones por su efectividad al precipitar siendo el anión sulfato el 3er más potente y el catión amonio el primero.
Debido a las concentraciones obtenidas, podemos ver en los gráficos que nuestra concentración de proteína inicial fue mayor que la proteína final, debido a las pérdidas cuando se pasó la solución a varios tubos. También a la baja actividad enzimática que pudimos haber obtenido, donde los factores que influyen son cambios bruscos de temperatura, reversibilidad de las reacciones, inhibición de la enzima, bajas concentraciones de proteína (Martínez, 2012), los cuáles se pueden evitar muestreando en tiempos cortos y evitar concentraciones bajas.
Se realizó una segunda centrifugación al obtener valores negativos en la cuantificación de proteína por el método de Bradford en las tres primeras pastillas. Para obtener nuevos resultados, donde la concentración proteica fue mayor a las muestras anteriores. Al analizar nuestra enzima en el método cualitativo de fécula de maíz, obtuvimos resultados positivos de alfa-amilasa al notarse un cambio de café oscuro a rojizo menos intenso, debido a las sales de yodo presentes (Toledo, 2014).
Se obtuvieron resultados negativos de DNS por lo que podemos suponer que no hay aumento de grupos reductores. Podemos suponer por los resultados obtenidos en la nula actividad enzimática debido a que la enzima alfa amilasa cataliza la hidrólisis rápida, de los enlaces internos 𝜶(1-4), y esta hidrólisis se sigue mediante la reducción de 3´a 5´-dinitrosalicilico a 3- amino-5 dinitrosalicílico (el producto coloreado que absorbe a 540 nm en el método de DNS).
La temperatura ideal a la que la enzima realiza su trabajo, es a los 70 ºC según el estudio de Espinel y López, 2009; aunque la enzima trabaja en un rango aceptable de 0-50 ºC, aunque está reportado que un 30% de actividad, siendo sometida a una temperatura 90ºC por una hora. Los rangos en los que manejamos las muestras fueron en los rangos de 0-4ºC, donde según la fuente citada no debe de verse afectada la producción aunque no se encuentra en su ideal.
También consideramos los posibles inhibidores que pudieron afectar la enzima, los cuales se unen al sitio activo de manera competitiva, donde el sustrato y la enzima compiten por el este sitio (Donoso J, 2006). En el manual de actividad enzimática de Worthinghton 2017, menciona que algunos inhibidores de amilasas son compuestos fenólicos, extractos de plantas y otros compuestos con grupos aminos como urea; que lo podemos encontrar en la ruta de desaminación de proteínas, como compuesto de desecho principal por la levadura (Cooper y Sumrada, 1974).
Debido a que en la mayoría de las alfa-amilasas se encuentran grupos Ca2+ y Cl- que le dan estabilidad a la estructura del complejo enzimático, justo donde el sitio catalítico de la reacción se lleva a cabo, como mejora a la metodología podríamos agregar estas sales a concentraciones bajas para poder potencializar la actividad y estabilidad de la enzima (PDB, 2006).
Verde: Cl- Gris: Ca2+ Rosa: sitio de anclaje Amarillo: cadena de carbohidratos
Post-laboratorios
Práctica 2
Práctica 3
Menciona tres métodos de precipitación de enzimas.
- Precipitación con sales: La adición de sales elimina el agua de la proteína hidratada, dejando las regiones hidrofóbicas en libertad de combinarse intermolecularmente.
-Precipitación isoeléctrica: Esta técnica se basa en la disminución de la solubilidad en el punto isoeléctrico.
- Precipitación con solventes: Esta técnica se basa en la disminución de la solubilidad mediante la adición de un solvente orgánico ligeramente polar.
- Precipitación con polímeros no iónicos: La precipitación de proteínas también puede realizarse utilizando polímeros neutros como el polietilenglicol (PEG) en lugar de sales o solventes. El mecanismo no está claramente establecido; sin embargo, hay dos modelos propuestos (Ogston y Laurent).
2. ¿Cuáles son las condiciones de centrifugación que se emplean industrialmente (T y rpm)?
Temperatura de 0-4°C y 10 000 rpm.
3. ¿Cuáles son los métodos para lisis para liberar enzimas intracelulares?
Métodos químicos de lisis celular (Álcalis, Lisozima y EDTA, Detergentes, Disolventes orgánicos, Choque osmótico, Choque por enfriamiento.
Métodos físicos de lisis celular (Sonicación, Cizalla líquida, Cizalla sólida, Congelación y descongelación).
4. Investigue por lo menos un método cromatográfico para separar enzimas.
Por cromatografía de exclusión molecular (a menudo también llamada filtración en gel o de tamiz molecular),es una de las técnicas más sencillas de las empleadas en la separación de proteínas y ácidos nucleicos. Este tipo de cromatografía se realiza en columnas cilíndricas rellenas con algunos de los geles que se fabrican con este fín y que pueden ser de varios tipos: dextranos con enlaces cruzados (sephadex), agarosa (sepharose, Bio-gel A), poliacrilamida (Bio-gel B), etc. Todos estos geles (fase estacionaria) se hallan constituidos por gránulos (particulas) de un material esponjoso hidratado, que contiene poros con un tamaño de diámetro determinado. Cuando se hace pasar una mezcla de moléculas de distinto tamaño, a través de una columna de filtración en gel; aquellas moléculas con un tamaño mayor que el diámetro de los poros de las particulas, sólo podran moverse en su camino, a través de la fase estacionaria, en el espacio que queda entre las partículas; y por lo tanto, no se verán retrasadas en su descenso.
Cromatografía hidrofóbica. la fase estacionaria es apolar (hidrofóbica), es decir, la proteína se pega al soporte por los resto de aminoácidos apolares, cuanto más residuos de este Filtración Tema 6. Purificación de proteínas Bioquímica 5 tipo tenga en su superficie, más apolar será, más se retendrá en la columna y se eluirá más tarde. En este caso a elusión se realiza aumentando la apolaridad de fase móvil.
5. Investigue el uso de membranas en la purificación de enzimas.
Pueden utilizarse como tales disoluciones acuosas de tampones específicos para proteínas solubles o bien que contengan además detergentes si se pretende purificar proteínas asociadas a membranas.
Anexos
*** Se adjunta a continuación la presentación realizada para el vídeo
Referencias
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